摘要在人原代肝细胞Primary Human Hepatocytes, PHH相关研究中传统悬浮人肝细胞SHH由于培养时间短、代谢稳定性有限难以满足慢代谢药物研究需求。因此HepatoPac、肝细胞球体Spheroids以及三培养系统TCS等长期培养模型逐渐成为药物代谢研究的重要工具。本文围绕三种长期原代人肝细胞模型与SHH在体外代谢性能方面的差异展开分析并结合BI 425809、BI-A与TAK-041等化合物的代谢结果对不同模型在I相与II相代谢物生成、连续代谢能力以及慢代谢药物研究中的应用价值进行比较。关键词人原代肝细胞、Primary Human Hepatocytes、HepatoPac、Spheroids、TCS、药物代谢、慢代谢药物、肝细胞模型、ADME、药物筛选、LifeNet Health一、为什么慢代谢药物研究越来越依赖长期原代肝细胞模型在药物研发过程中肝脏代谢研究是决定药物安全性与有效性的关键环节。药物进入人体后会在肝脏中经历氧化、还原、水解以及结合等复杂代谢过程而这些代谢反应往往直接影响药物在体内的暴露时间、毒性风险以及最终疗效。传统悬浮人肝细胞Suspended Human HepatocytesSHH由于操作简单因此长期以来一直被广泛应用于体外药物代谢研究。但SHH模型通常只能维持数小时代谢活性因此对于慢代谢药物、多步连续代谢过程以及复杂II相代谢物研究存在明显局限。尤其是在一些慢清除药物研究中由于药物在体内停留时间长往往会产生多种连续代谢产物而传统SHH体系很难完整模拟这些长期代谢过程。因此能够维持更长期代谢酶活性的原代肝细胞培养模型开始受到越来越多关注。目前HepatoPac、肝细胞球体Spheroids以及三培养系统TCS等长期培养模型已经成为慢代谢药物研究中的重要体外工具。此外近年来不少研究也开始关注来源稳定、功能保持较好的原代肝细胞体系以提升长期培养模型的数据稳定性与代谢预测能力。关于相关人原代肝细胞与培养体系资料也可以参考https://www.mine-bio.com/LifeNet_PrimaryCells_Medium/?utm_sourcecsdnutm_mediumreferralutm_campaignlifenet_article二、本研究如何比较三种长期肝细胞模型为了比较不同长期培养模型在慢代谢药物研究中的能力本研究选择了三种在人血浆中存在复杂循环代谢物、但在SHH体系中代谢较弱或无法完整检测的化合物作为研究对象包括BI 425809、BI-A以及TAK-041。研究分别采用HepatoPac肝细胞球体Spheroids三培养系统TCSSHH悬浮人肝细胞四种体系进行对比。实验中研究人员利用质谱法MS分析药物相关物质总量TDRM并对比各模型中原药消耗比例、I相与II相代谢物种类以及与人体血浆代谢结果之间的相关性。表1三种长期原代人肝细胞培养模型三、BI 425809在不同肝细胞模型中的代谢差异BI 425809属于典型慢代谢化合物在人体内会形成多种循环代谢物因此非常适合作为长期代谢模型验证对象。研究结果显示在三种长期培养模型中均能够检测到人体内11种循环代谢物中的8种而SHH体系则存在明显缺失。其中Spheroids与TCS能够检测到M232与M312等连续代谢产物而SHH与HepatoPac无法检测这些代谢物。此外HepatoPac在部分氧化代谢物生成方面具有一定优势而TCS中M232与M312占比较高说明其在复杂连续代谢过程模拟方面表现较好。图1BI 425809预测代谢途径表2人血浆和肝细胞中鉴定出的BI 425809及其代谢产物这些结果说明长期原代肝细胞模型在慢代谢药物以及复杂代谢路径研究中能够更接近人体真实代谢状态。四、BI-A连续氧化与葡萄糖醛酸结合代谢研究BI-A在人体内存在氧化代谢以及氧化后进一步葡萄糖醛酸结合等连续代谢过程。研究发现SHH体系无法检测到两步连续氧化-葡萄糖醛酸结合代谢物而三种长期培养模型均能够成功检测到相关代谢物。其中TCS模型中M5451代谢物占比达到约10%。这一结果说明长期培养模型对于II相代谢研究以及连续代谢过程模拟具有更高价值。图2BI-A的预测代谢途径表3人血浆和肝细胞中鉴定出的BI-A及其代谢产物五、TAK-041复杂连续代谢研究结果TAK-041属于体内存在多步连续代谢的化合物在人体内可产生谷胱甘肽结合物、半胱氨酸S-结合物以及氧化结合代谢物等复杂代谢产物。实验结果显示在SHH体系中几乎无法观察到相关代谢物而三种长期培养模型均能够生成体内相关连续代谢物。其中TCS模型中M1半胱氨酸占比约17%M2葡萄糖醛酸氧化占比约12%说明长期培养体系在复杂代谢路径研究中明显优于传统SHH模型。图3TAK-041的预测代谢途径表4人血浆和肝细胞中鉴定出的TAK-041及其代谢产物六、不同长期培养模型在原药消耗方面的差异研究进一步比较了三种长期培养模型对不同药物的原药消耗能力。结果显示对BI 425809的代谢TCS高于Spheroids与HepatoPac对BI-A的代谢TCS与Spheroids接近对TAK-041的代谢Spheroids优于TCSHepatoPac则存在较明显药物依赖性差异总体来看TCS与Spheroids在多种慢代谢药物研究中表现出更稳定的代谢活性而HepatoPac在不同药物之间存在较明显差异。图4孵育7天后HepatoPac、Spheroids和TCS中原药消耗百分比七、长期原代肝细胞模型的应用价值与局限性虽然长期培养模型相比SHH具有更好的代谢能力但不同体系仍然存在各自局限性。例如SHH培养时间较短HepatoPac存在小鼠成纤维细胞背景Spheroids培养后部分CYP450活性下降TCS体系中部分培养成分不完全明确因此在实际药物研发过程中研究人员通常需要根据药物类型、代谢路径以及研究目标选择最适合的肝细胞模型。表5体外模型在熟悉度、成本、实用性及注意事项方面的考察对比此外长期培养体系对于原代肝细胞本身的质量要求也更高。如果细胞来源不稳定、代谢酶功能下降或者细胞活力不足都可能影响长期代谢研究结果。因此目前不少研究机构会优先选择功能稳定、来源规范且适合长期培养的人原代肝细胞体系。图LifeNet Health人原代肝细胞相关产品八、总结随着慢代谢药物研究、复杂连续代谢研究以及ADME评价需求不断增加长期原代人肝细胞培养模型正在逐渐成为药物研发中的重要工具。相比传统SHH体系HepatoPac、Spheroids以及TCS能够维持更长期、更稳定的代谢酶活性并能够更有效模拟人体内复杂I相与II相代谢过程。其中TCS与Spheroids在多种慢代谢化合物研究中表现出较高代谢能力而不同模型在代谢路径、培养稳定性以及适用药物类型方面仍存在差异因此需要结合具体研究目标进行选择。未来随着原代肝细胞来源优化以及长期培养技术不断完善体外肝代谢模型有望进一步提升药物代谢预测能力并在新药研发、安全性评价以及个体化医学研究中发挥更重要作用。本文根据人原代肝细胞、三培养系统、药物慢代谢研究等相关应用技术文章、参考文章等公开资料曼博生物整理用于科学技术研究和相关实验学习参考。参考资料Kamel, A., Bowlin, S., Hosea, N., Arkilo, D., Laurenza, A. (2021). In Vitro Metabolism of Slowly Cleared G Protein–Coupled Receptor 139 Agonist TAK-041 Using Rat, Dog, Monkey, and Human Hepatocyte Models (HepatoPac): Correlation with In Vivo Metabolism. Drug Metabolism and Disposition, 49(2), 121-132.DOIhttps://doi.org/10.1124/dmd.120.000246