抗体是现代生物医学研究和诊断的重要工具尤其是单克隆抗体简称单抗因为其特异性强、重复性高一直是科研和临床领域的宠儿。然而传统的单抗制备方法也存在一些局限性。近年来重组兔单克隆抗体的兴起为解决这些问题带来了新的可能。为什么是重组兔单克隆抗体重组兔单克隆抗体结合了兔免疫系统的独特优势和现代基因工程技术具有多方面的优点1.特异性好亲和力更强兔单抗的CDR3区更长具有更强的可变性、成熟性更好亲和力是鼠单抗的10~100倍其KD甚至可达到皮摩尔级(KD10^-12 mol/L)2.识别更多的表位兔子属于兔型目在进化上与锯齿目不同人类抗原在兔子中呈现更强的免疫原性产生的抗体表位和数量更加丰富并能识别稀有抗原如磷酸化抗原、小分子化合物等。3.体型优势有更大的淋巴细胞池和更广泛地抗体表位兔子的脾胀是小鼠的50倍可以获得更多的B细胞和更广泛地表位。4.结构更简单、半衰期更长兔单抗只有一个IgG结构易于人源化改造其次鼠单抗在血清中的半衰期较短且可诱导产生人抗鼠抗体而兔单抗则显示出较长的半衰期及较低的免疫原性同时保留了对人类抗原的高特异性和亲和力。5.高稳定性、高批间一致性批次一致性与无限的可重复性基因序列永存随时生产。图1:天然兔、鼠、鸡和人免疫球蛋白示意图兔单克隆抗体的开发的技术路线目前对于兔单克隆抗体的开发一共有3大技术路线一是传统的杂交瘤技术平台该技术筛选的是抗体分泌型浆B细胞Plasma B cells 二是噬菌体展示技术该技术直接对B细胞进行测序和建库抗体序列来源可以是浆细胞也可以是记忆细胞Memory B cells三是基于单B细胞直接测序或者基于B细胞体外培养筛选后测序技术该技术抗体序列来源可以是浆细胞也可以是记忆细胞。1.杂交瘤技术小鼠杂交瘤技术依赖于B细胞与骨髓瘤伙伴的细胞融合自1975年被发现以来是一种传统的、最广泛和最成功地用于生产小鼠单抗的方法(图2)。该方法将免疫小鼠的淋巴细胞与BALB/c小鼠骨髓瘤细胞融合形成永生化杂交瘤细胞然后对杂交瘤细胞进行筛选以鉴定产生相同抗体的特定克隆(图2)。杂交瘤技术是一种成熟的制备鼠源性单抗的方法并被广泛用于生产各种应用的抗体。然而由于缺乏合适的骨髓瘤配对杂交瘤方法大多局限于啮齿动物免疫。在20世纪80年代一种用于生产治疗性抗体的人类杂交瘤技术被开发出来这种抗体可以产生天然形式的人类抗体。这种人类杂交瘤技术开发了另一种有用的方法来产生治疗性抗体而不需要额外的修改。许多研究致力于这项技术并发现了几个有用的人类融合伙伴细胞系。基于更好的融合伙伴的发展和使用电融合的技术进步提高了人杂交瘤融合的成功率这可以在不久的将来推动治疗性抗体的发展。2.噬菌体展示技术自20世纪90年代初噬菌体展示技术被探索为一种新的产生单抗的方法。在这种方法中从淋巴细胞中获得V基因库并将VHS和VLS的组合克隆到丝状噬菌体的表面并通过与其外壳蛋白的融合表达(图2)然后选择在其顶端含有表达特异性单抗的噬菌体颗粒用于常规检测与实际上仅限于啮齿动物的杂交瘤技术相比噬菌体展示技术已成功地用于从任何已知免疫球蛋白基因的物种中筛选和分离单抗。2000年Rader等人首先描述了用噬菌体展示技术筛选兔单抗的全过程该技术成功地应用于结肠癌免疫治疗靶抗原人A33抗原兔抗体的筛选和人源化获得的人源化抗体与人A33抗原具有较高的特异性和亲和力。目前抗体噬菌体展示技术以其快速、简便的抗体生成和体外控制各种选择参数的能力是产生完全用于治疗目的抗体的主要技术平台根据我们对抗体结构、功能和序列多样性的了解除了从以前的抗体库中获得的见解外一种新的合成抗体库技术被开发出来并通过将精确设计的序列插入到抗原结合位点来用于mAb的生产这项技术是基于遗传复制免疫球蛋白片段和使用分子生物学技术在体外使抗体副表位多样化而完成的设计了几个具有多个可变重链和轻链骨架区域的合成抗体库并用于分离优化的分子识别人单。3.单B细胞开发技术尽管杂交瘤筛选与展示技术已被应用于兔源单克隆抗体的生产但二者均存在局限性杂交瘤技术存在细胞融合效率低的问题而展示技术则易导致抗体VH与VL的天然配对丢失。为克服上述缺陷单B细胞抗体技术近年来迅速发展图2C该技术流程包括1从外周血或淋巴组织中通过随机分选或FACS鉴定并分离特异性单B细胞2利用抗体特异性引物进行单细胞逆转录聚合酶链式反应RT-PCR3通过PCR扩增免疫球蛋白Ig基因并进行测序4将Ig基因克隆至表达载体5在大肠杆菌等原核系统或HEK 293、CHO等真核系统中表达抗体蛋白6通过蛋白纯化及酶联免疫吸附试验ELISA评估抗体活性。单B细胞抗体技术是高效和稳健的可以在短时间内从免疫兔中产生大量抗原特异性重组抗体。这种方法已用于产生一些治疗性中和单克隆抗体用于治疗多种疾病包括癌症、自身免疫性疾病和传染病例如使用单B细胞抗体技术从HIV患者中分离出几种有价值的mAb用于临床诊断。图2.概述抗原特异性单抗产生的流程图。(A)小鼠杂交瘤方法。(B)噬菌体展示方法。(C)单一B细胞抗体技术。
