摘要白喉毒素、白喉类毒素与CRM197同源于相同蛋白骨架但脱毒方式截然不同。本文拆解三者的结构、毒性机制与分子特性分析其在偶联位点、均一性、抗载体抗体等方面的差异为结合疫苗载体选型提供参考。关键词CRM197、白喉毒素无毒突变体、白喉毒素、白喉类毒素、CRM197蛋白、结合疫苗载体、疫苗开发、多糖偶联、ADP核糖基化、抗载体抗体、载体蛋白在结合疫苗研发与生产场景中白喉毒素、白喉类毒素、CRM197白喉毒素无毒突变体三个术语常被混用。三者不仅名称相近在毒力机制、脱毒方式、分子均一性、可用偶联位点等方面也存在明确差异这些差异直接影响结合疫苗载体蛋白的选型与关键质量属性。本文梳理三者的分子结构、毒性机制与技术特点并结合公开结构研究及相关免疫学文献进行分析为结合疫苗载体选型提供参考。一、白喉毒素的分子结构与毒性机制白喉毒素Diphtheria ToxinDT由溶原化的白喉棒状杆菌分泌编码毒素的tox基因位于β棒状杆菌噬菌体上仅携带该噬菌体的菌株才可产生毒素。白喉毒素属于具有明确细胞作用机制的细菌外毒素其毒性与蛋白质的受体识别、胞内转位以及ADP-核糖基转移酶活性密切相关因此理解其分子结构是区分白喉类毒素与CRM197不同脱毒方式的基础。图1白喉毒素diphtheria toxinDT虚拟示意图成熟白喉毒素为单链蛋白共535个氨基酸分子量约58 kDa经蛋白酶酶切后由二硫键连接形成A、B两个片段。其结构可分为催化域、跨膜域以及受体结合域三个主要功能区域各结构域分别参与酶催化、内体膜转位和细胞受体识别共同构成天然白喉毒素完整的细胞作用机制。结构域残基范围功能催化域C 区1~187 位ADP-核糖基转移酶活性中心跨膜域T 区201~384 位介导内体膜转位受体结合域R 区387~535 位识别细胞表面受体表1白喉毒素的三个功能域白喉毒素毒性作用遵循明确的细胞通路。首先受体结合域R区结合细胞表面的HB-EGF肝素结合表皮生长因子样生长因子相关受体随后通过受体介导的内吞过程进入细胞内体。当内体酸化后跨膜域T区参与内体膜转位使催化相关A片段进入细胞质。进入细胞质的A片段以NAD⁺为底物将ADP-核糖基转移至真核翻译延伸因子eEF2的特殊组氨酸衍生残基即白喉酰胺Diphthamide上。经过这一修饰eEF2正常功能受到抑制细胞蛋白质合成受阻最终可能导致细胞死亡。白喉毒素具有较强生物活性原稿所引述的历史文献资料中曾记载人的致死剂量估计约为0.1 μg/kg体重并指出极少量具有催化活性的毒素片段进入胞质后即可产生显著细胞作用。此类历史毒理数值应结合具体文献、暴露途径及研究条件理解不能直接用于其他实验场景推算。对白喉毒素的机制研究而言最核心的认识仍然是其毒性来源于对eEF2的酶学修饰及后续蛋白质合成抑制。图2白喉酰胺Diphthamide一种翻译后修饰的组氨酸氨基酸二、白喉类毒素甲醛介导的化学脱毒白喉类毒素Diphtheria Toxoid是较早应用的白喉脱毒产物。1923年巴斯德研究所相关研究报道白喉毒素经过甲醛处理并加热后毒性可以降低同时仍保留一定抗原性能够诱导机体产生中和抗体。这一技术路线也是后来白喉疫苗及百白破相关疫苗发展的重要基础。一脱毒原理甲醛可以与蛋白质侧链的氨基发生反应特别是赖氨酸残基上的相关官能团并可能形成蛋白质分子内和分子间交联。通过这种化学修饰原本与毒素活性相关的蛋白质局部结构、酶活性位点及其空间构象可能受到影响从而使天然白喉毒素的酶活性和毒性显著降低或消除。与明确的氨基酸单点突变不同甲醛脱毒属于非定点化学修饰因此不同蛋白质分子可能发生不同程度的侧链反应及交联最终产物具有一定结构异质性。这种差异对于作为疫苗抗原的类毒素材料和作为多糖结合疫苗载体的蛋白质材料都属于需要通过实际工艺和质量控制进一步评价的问题。二技术特点由于化学脱毒属于非定点修饰白喉类毒素通常具有以下技术特点。首先分子异质性相对较高产物可能包含多种不同修饰形式的蛋白质分子批次间化学修饰分布也可能存在差异。原稿提到相关化学脱毒产物的纯度通常在60%~70%区间但这一数据应理解为所引用资料中的特定描述不能作为全部白喉类毒素制品通用的纯度标准具体纯度需要根据工艺与分析方法确认。其次部分抗原表位可能受到影响。甲醛交联及侧链修饰可能改变部分T细胞或B细胞相关表位的结构或暴露状态从而影响抗原加工和免疫识别。第三可用偶联位点可能减少。赖氨酸的氨基既可能成为甲醛修饰的主要作用位点也是部分多糖偶联反应采用的官能团因此化学脱毒与后续偶联之间可能存在位点利用上的联系。此外化学脱毒还需要关注毒性回复和脱毒试剂残留问题。原稿指出部分条件下去除游离甲醛或者改变处理环境以后可能存在毒性回复风险因此相关制造工艺需要开展残余毒性、回复毒性及游离甲醛残留控制并结合适当的质量要求确认最终材料的安全性与一致性。作为疫苗抗原白喉类毒素具有长期研究和应用基础能够用于常规免疫相关制剂但当其进一步作为结合疫苗载体蛋白时上述化学修饰、蛋白质异质性、可用偶联位点以及残留控制等特点就可能直接影响后续多糖偶联工艺和最终产品质量表征。三、CRM197基因点突变实现毒性丧失CRM是Cross-reacting Material的缩写意为交叉反应物质通常指通过诱变筛选得到、能够与白喉毒素相关抗体发生免疫交叉反应的突变蛋白。该系列包括CRM30、CRM45和CRM197等多个突变体其中CRM197由于整体结构与野生型白喉毒素差异较小、同时缺乏正常的毒素酶活性成为结合疫苗载体研究中应用较多的蛋白材料。与甲醛化学脱毒产物不同CRM197的毒性丧失由明确的基因突变造成因此其蛋白质序列和主要结构特征更容易得到清晰描述。有关CRM197载体蛋白的相关技术资料也主要围绕其无毒突变体的分子结构、载体蛋白应用与相关研究特性展开。一分子基础CRM197与野生型白喉毒素仅相差1个氨基酸第52位甘氨酸突变为谷氨酸G52E对应tox基因上的一个G→A单碱基突变。与天然白喉毒素相比这一变化并未造成蛋白质整体骨架发生完全不同的折叠却显著影响了原本与毒素催化功能有关的结构区域。2012年相关晶体结构研究进一步阐明CRM197毒性丧失的分子基础。研究显示CRM197整体折叠与野生型白喉毒素高度相似但覆盖NAD结合口袋的活性位点环柔性增加影响正常NAD⁺结合及ADP-核糖基转移酶催化功能因此失去天然白喉毒素相关的正常酶活性与毒性。图3CRM197蛋白虚拟结构图二相比化学脱毒的技术特点由于CRM197的毒性通过基因层面的单点突变而丧失因此与传统甲醛脱毒的白喉类毒素相比具有若干不同技术特征。首先无需采用甲醛化学脱毒步骤因此不会因为该脱毒步骤引入甲醛残留也不涉及同一化学脱毒机制下的毒性回复问题。不过这不应理解为CRM197材料可以省略常规的身份、纯度、残余活性及其他质量评价。其次分子均一性相对较好。CRM197的蛋白质序列和核心结构具有明确的分子基础不需要通过多个不同位置的非定点化学修饰形成无毒蛋白因此更有利于结构表征和批间质量控制。与此同时赖氨酸偶联位点得到保留。原稿指出CRM197序列中具有39个赖氨酸残基由于不经过甲醛脱毒这些位点不会因为甲醛修饰而被消耗可以作为后续多糖偶联研究中的潜在反应位点。但实际可反应位点数量仍需根据蛋白质空间构象和偶联化学判断。另外相关抗原表位保留程度较高。由于CRM197未经历甲醛交联与侧链修饰蛋白质原有结构与部分T细胞、B细胞相关表位能够得到更多保留这也是其能够作为载体蛋白开展免疫学研究的重要原因之一。最后原稿还提到部分研究中CRM197相关的抗载体抗体水平相对较低。这一现象可以用于讨论不同载体可能产生的免疫应答差异但实际抗体水平与蛋白质状态、抗原配方、既往免疫背景和免疫程序有关不应将相关比较结果理解为适用于所有疫苗制剂的固定结论。四、三者差异与结合疫苗载体选型结合疫苗的基本原理是将细菌荚膜多糖等抗原与适当载体蛋白进行偶联。部分荚膜多糖属于TI-2型胸腺非依赖性抗原在婴幼儿等人群中可能难以产生理想的高亲和力抗体和持久免疫记忆。通过与蛋白质载体连接多糖抗原能够获得T细胞相关免疫帮助从而改善高亲和力IgG产生和记忆B细胞形成。因此结合疫苗载体不仅是多糖连接的化学支架也具有重要的免疫学功能。载体蛋白选型需要同时考虑蛋白质结构、可用偶联位点、抗原表位完整性、分子均一性、残留控制及相关抗载体免疫应答。白喉类毒素和CRM197具有共同的蛋白质来源但二者的脱毒方法不同因此在这些方面存在技术差异。选型维度白喉类毒素CRM197可用偶联位点赖氨酸被甲醛修饰消耗数量减少完整保留可用于偶联T 细胞表位完整性交联修饰可能掩盖部分表位无化学修饰表位更完整分子均一性异质性较高混合物结构单一确定脱毒试剂残留需控制游离甲醛含量无抗载体抗体水平相对较高相对较低典型应用场景白喉疫苗抗原DTaP、Td 等结合疫苗载体蛋白表2白喉类毒素与CRM197作为结合疫苗载体的对比关于抗载体抗体与载体诱导的表位抑制Carrier-Induced Epitopic SuppressionCIES需要进一步说明两个问题。首先抗载体抗体水平较低不等于蛋白质免疫原性弱或完全没有免疫原性。CRM197虽然不具有天然白喉毒素的正常酶活性但仍然保留与天然毒素相关的抗原结构和免疫识别能力。白喉类毒素由于经历甲醛交联和修饰在部分研究条件下作为游离蛋白可能表现出不同的免疫原性这些差异可能与蛋白质结构、抗原加工及表位呈现有关。其次既往针对载体蛋白的免疫背景可能影响部分结合疫苗的免疫应答。由于含白喉类毒素的疫苗长期应用人群中可能存在预存抗白喉相关免疫应答。原稿指出某些研究观察到CRM197与白喉类毒素作为载体时产生的抗载体抗体水平及预免疫影响存在差异相关研究也讨论了CIES现象。不过这种差异并不意味着CRM197在所有疫苗制剂中都能避免载体相关免疫干扰CIES的具体临床意义在学术研究中仍然存在讨论。因此CRM197和白喉类毒素作为结合疫苗载体时不能只比较材料名称或是否属于白喉毒素相关蛋白更需要结合具体多糖抗原、偶联化学、蛋白质质量以及免疫程序分析哪一种材料更适合目标研发体系。五、常见误区一“CRM197就是脱毒的白喉毒素”这一说法不够准确。白喉类毒素属于通过甲醛等化学方式获得的脱毒蛋白CRM197则属于通过G52E单点突变丧失天然白喉毒素酶活性的蛋白质突变体。二者虽然与天然白喉毒素具有共同的结构来源但在制备路径、蛋白质化学修饰、分子均一性以及脱毒试剂残留等方面并不相同。因此更准确的理解方式是将白喉类毒素归为化学脱毒蛋白将CRM197归为无毒白喉毒素突变蛋白。二“CRM197没有免疫原性”这一说法同样不准确。CRM197缺乏正常的天然白喉毒素催化活性但其大部分原始抗原表位仍然得到保留因此能够被免疫系统识别并产生相关应答。部分研究比较中CRM197作为游离蛋白或载体蛋白时的抗体应答可能与白喉类毒素存在差异但这种差异不能解释为CRM197完全没有免疫原性也不能仅凭某一项抗载体抗体数据推断结合疫苗最终免疫效果。三“白喉类毒素和CRM197可以互换使用”不建议直接互换。白喉类毒素和CRM197具有不同的毒性消除方式其分子修饰程度、表位完整性、赖氨酸偶联位点及质量控制方法都存在差异。对于已经建立的多糖偶联工艺如果将一种载体替换为另一种应重新评价偶联反应、结合产物的质量属性、相关免疫应答以及对应研发和申报资料而不能只因为两种蛋白质具有共同结构来源就认为其能够在现有工艺中直接替代。结语白喉毒素、白喉类毒素与CRM197共享同一535个氨基酸的蛋白质结构基础但其毒性状态以及获得无毒蛋白的方式存在明显区别。天然白喉毒素保留完整的ADP-核糖基转移酶活性能够通过修饰eEF2抑制细胞蛋白质合成白喉类毒素主要通过甲醛化学处理降低或消除毒性同时可能伴随分子异质性增加、部分偶联位点减少及表位改变等问题CRM197则主要通过G52E单点突变丧失正常催化活性使蛋白质在保留大部分天然结构特征的同时获得不同于化学类毒素的分子性质。对于结合疫苗载体蛋白研究理解这三类材料的结构来源、毒性机制与脱毒方式有助于进一步开展偶联位点分析、蛋白质质量表征、免疫原性比较以及载体选型。实际研究仍需结合目标多糖抗原、具体偶联工艺和所使用蛋白材料的质量要求进行验证而不能将单一分子特征直接等同于最终疫苗制剂的整体表现。参考文献[1] Uchida T, Pappenheimer AM Jr, Greany R. Diphtheria toxin and related proteins. I. Isolation and properties of mutant proteins serologically related to diphtheria toxin. J Biol Chem. 1973;248(11):3838-3844.[2] Giannini G, Rappuoli R, Ratti G. The amino-acid sequence of two non-toxic mutants of diphtheria toxin: CRM45 and CRM197. Nucleic Acids Res. 1984;12(10):4063-4069.[3] Malito E, Bursulaya B, Chen C, et al. Structural basis for lack of toxicity of the diphtheria toxin mutant CRM197. Proc Natl Acad Sci USA. 2012;109(14):5229-5234.[4] Bröker M, Costantino P, DeTora L, et al. Biochemical and biological characteristics of cross-reacting material 197 (CRM197), a non-toxic mutant of diphtheria toxin. Biologicals. 2011;39(4):195-204.[5] Pecetta S, Lo Surdo P, Tontini M, et al. Carrier priming with CRM197 or diphtheria toxoid has a different impact on the immunogenicity of the respective glycoconjugates. Vaccine. 2015;33(2):314-320.[6] Choe S, Bennett MJ, Fujii G, et al. The crystal structure of diphtheria toxin. Nature. 1992;357(6375):216-220.关于技术来源本文基于公开学术文献及CRM197相关技术资料曼博生物MineBio整理仅用于科研交流、蛋白质结构研究和结合疫苗载体技术参考。文中关于白喉毒素催化机制、化学脱毒、G52E突变、39个赖氨酸残基及抗载体免疫应答等内容均需要结合对应文献及具体研究条件理解。涉及CRM197研究材料时应确认其适用级别和质量要求科研级蛋白材料不应未经相应评价直接用于人体疾病诊断、治疗或临床疫苗生产。