膜蛋白靶点也能筛代谢物小分子垂钓多次跨膜靶蛋白Cell大子刊用DARTS-MSDARTS-WBNMR解析IVA靶向膜蛋白GPR109A抑制心肌细胞焦亡机制摘要肠菌代谢物研究常见难点是从相关性走向明确靶点。本文以异戊酸IVA为例通过DARTS-MS筛选、DARTS-WB验证、分子对接模拟、NMR结合实验和GPR109A敲低确认IVA作用七次跨膜受体GPR109A并解析其抑制STAT3-GSDME焦亡环路的机制。肠菌代谢物是这几年的研究热点但现在真正能拉开文章层次的是什么往往不是证明某个菌变多或变少而是进一步回答这个菌产生了什么代谢物这个代谢物进入宿主后作用于哪个靶蛋白这个靶点能否解释下游表型2026年西安交通大学等团队在Cell Metabolism中科院一区/JCRQ1IF37.0发表最新研究题为Gut microbiota-derived isovaleric acid alleviates atrial fibrillation by suppressing GSDME-dependent pyroptosis。尤其值得注意的是本文筛到并验证的GPR109A是典型GPCR也就是七次跨膜蛋白。不少同学会问膜蛋白能不能做小分子靶点筛选这篇文章对很多膜蛋白课题很有参考价值。一、先证明IVA是功能性代谢物首先在人群样本中发现房颤患者的肠道菌群结构发生改变其中R. gnavus是一种存在于人体肠道中的厌氧菌属于肠道共生菌的一类丰度下降较为明显同时血清异戊酸IVA水平降低。进一步使用小鼠模型进行验证。结果显示R. gnavus减轻无菌小鼠房颤的病理表型。这一部分解决的问题IVA来自哪里是否与R. gnavus功能相关是否能解释菌群保护作用。二、DARTS-MS从细胞裂解液直接钓出膜蛋白靶点确定IVA后关键问题变成IVA通过哪个宿主蛋白发挥作用本文采用DARTS-MS做无标记靶点筛选。DARTS的核心原理是小分子与蛋白结合后可能改变蛋白构象或稳定性使该蛋白对蛋白酶降解更耐受。与需要化学修饰的探针法相比DARTS更适合一些结构简单、不容易改造的代谢物小分子。DARTS-MS的方法可以实现在细胞裂解液中完成将HL-1心肌细胞裂解液分别与IVA或PBS孵育再加入pronase进行有限蛋白酶消化。随后样品经SDS-PAGE分离观察IVA处理后受保护增强的蛋白条带并切取对应条带进行LC-MS/MS鉴定。结果显示GPR109A是IVA重要候选靶点。GPR109A是G蛋白偶联受体属于多次跨膜膜蛋白。这个结果对技术服务场景很有价值因为膜蛋白由于跨膜区多、构象依赖强、表达纯化难常被认为是靶点筛选和互作验证中的难点。但本文说明在合适实验策略下代谢物小分子同样可以筛到膜蛋白受体靶点。图 1 DARTS-MS流程及结果图三、DARTS-WB验证IVA保护GPR109A免受蛋白酶降解研究人员进一步采用DARTS-WB检测小分子IVA是否能保护膜蛋白GPR109A。DARTS-WB实验方法HL-1细胞裂解液先与IVA孵育再经蛋白酶处理随后通过Western blot检测GPR109A蛋白量。DARTS-WB解读原则如果IVA与GPR109A结合并提高其抗蛋白酶消化能力那么在相同蛋白酶处理条件下GPR109A条带应在IVA组中保留更多。DARTS-WB结果显示IVA可以保护GPR109A免受蛋白酶降解而对其他短链脂肪酸相关受体没有类似保护作用。这说明IVA对GPR109A的保护具有一定选择性进一步支持GPR109A是IVA作用相关受体。图 2 DARTS-WB结果图四、分子对接预测IVA进入GPR109A结合口袋分子对接的是从结构层面预测IVA是否能够进入GPR109A结合口袋并与受体形成相对合理的相互作用。结果显示IVA可以进入GPR109A结合口袋并表现出相对特异的结合趋势优于其他短链脂肪酸说明IVA与GPR109A之间存在合理的结合模式。图 3 分子对接结果图尤其对于GPR109A这类多次跨膜受体分子对接可以帮助解释小分子可能进入哪个口袋、为什么表现出受体选择性。五、NMR结合实验确认IVA-GPR109A物理相互作用本文又进一步使用NMR验证IVA与GPR109A之间的生物物理相互作用。NMR实验设计分别在野生型HL-1细胞和使用siRNA敲低GPR109A的HL-1细胞中加入IVA收集细胞裂解液并进行NMR检测观察IVA特征峰是否依赖GPR109A存在。结果显示IVA特征信号可在野生型HL-1细胞裂解液中检测到当GPR109A被敲低后该结合相关信号减弱或消失表明GPR109A参与IVA在细胞裂解液中的物理结合过程。图 4 NMR结果图这一点对代谢物小分子研究很重要。很多代谢物分子量小、结构简单传统亲和力检测并不总是容易开展。NMR结合实验尤其适合小分子-蛋白或小分子-受体互作验证。这篇文章给膜蛋白靶点筛选的启发如果是可溶性蛋白pull-down、SPR、MST、ITC等方案相对容易设计但如果候选靶点是膜蛋白尤其是GPCR、转运体、离子通道等多次跨膜蛋白实验设计难度会明显增加。蛋白表达、纯化、构象稳定、配体结合状态、去垢剂体系都会影响结果。本公司的特色服务免纯化MST分子互作技术为膜蛋白的亲和力测定提供了一个新思路。对于膜蛋白、小分子代谢物、天然小分子和肠菌代谢产物相关课题这种设计非常值得参考。参考文献Ding N, Wu H, Hua Y, et al. Gut microbiota-derived isovaleric acid alleviates atrial fibrillation by suppressing GSDME-dependent pyroptosis. Cell Metab. 2026;38(2):370-387.e10. doi:10.1016/j.cmet.2025.12.017