导语在小分子药物研发中如何从复杂蛋白质组中筛选潜在作用靶点并进一步定位其共价结合位点是共价药物靶点发现的重要研究问题。isoTOP-ABPP同位素标记串联正交蛋白水解活性蛋白质组分析是一种基于竞争性标记与定量质谱分析的化学蛋白质组学技术可用于小分子共价靶点筛选及半胱氨酸反应性位点分析。ABPP并非单一的筛靶模式而是一套可依据化合物化学性质及其与蛋白作用方式灵活配置的技术平台。本篇在回顾原理要点的基础上重点梳理策略如何选与案例怎么用覆盖肿瘤、中药复方、老药新用、心血管保护与衰老干预等多个方向。一、技术原理竞争性定量是筛靶的关键传统isoTOP-ABPP用于刻画半胱氨酸反应性当研究目标转为小分子占据了哪个位点时则将isoTOP-ABPP技术的应用延伸至了小分子靶点及其结合位点的鉴定先用待研究的小分子处理实验组、用等量溶剂处理对照组再加入IA-Alkyne探针进行竞争标记若某一位点被小分子占据则探针在该位点的标记信号会显著下降据此即可推断小分子的结合位点。该策略最初用于脂质衍生亲电试剂的靶点研究之后被拓展至内源代谢物、天然产物与合成化合物库的全局靶点筛选。在定量层面除最早使用同位素标记缬氨酸实现的两重定量外还有结合还原二甲基化方法的rdTOP-ABPP三重定量、引入等重质量标签的iTRAQ/TMT二级定量以及将数据非依赖性采集DIA引入TOP-ABPP流程、具有覆盖度高、数据重现性好、定量准确等特点的DIA-ABPP。二、ABPP技术应用一个技术、多种策略对天然产物研究而言确认其生物活性往往只是第一步如何进一步找到其直接作用靶点才是机制研究中最棘手的环节。原因在于天然产物结构多样、反应基团各异其与蛋白质的相互作用模式也各不相同——因此靶点筛选并不存在一种适用于所有天然产物的固定探针策略。综合多项研究可以看到经常采用的化学蛋白质组策略大致有三类。第一类炔基标记 ABPP。这类策略更适用于具有共价结合特征的天然产物在活性分子中引入炔基手柄使小分子与靶蛋白形成稳定连接减少非共价结合在富集与洗涤过程中的解离从而实现对结合靶点的捕获与鉴定。例如含α-甲基环戊酮结构可作为Michael受体的冬凌草甲素、含α,β-不饱和羰基的藤黄酸均属此类。第二类光交联 ABPP。这类策略适用于非共价、弱相互作用或瞬时结合的天然产物通过在分子中引入光反应性基团如双吖丙啶在紫外照射下将可逆的分子—蛋白相互作用固定为稳定的共价连接并结合竞争组设计提高靶点筛选的特异性与覆盖度。第三类isoTOP-ABPP。与仅针对单一候选蛋白开展验证的研究策略不同isoTOP-ABPP 可在蛋白质组范围内分析小分子对反应性半胱氨酸位点的影响为共价药物靶点发现、潜在结合位点定位及靶点选择性研究提供线索。它在传统ABPP靶蛋白筛选的基础上引入了位点水平的定量分析通过比较探针标记程度的变化不仅能筛选共价作用蛋白还可进一步定位天然产物修饰的关键氨基酸位点。这一位点级信息对于理解共价药物的选择性、评估脱靶风险、指导结构优化尤为重要。三、isoTOP-ABPP应用场景跨疾病方向的靶点发现isoTOP-ABPP 可用于共价小分子药物的靶点筛选、天然产物潜在共价作用靶点发现以及候选化合物与蛋白质组中反应性半胱氨酸位点相互作用的研究。小分子抗肿瘤方向是应用最密集的领域之一冬凌草甲素靶向PRDX1Cys173启动ROS-内质网应激-自噬轴杀伤癌细胞、藤黄酸靶向SHMT2破坏线粒体一碳代谢与抗氧化稳态诱导三阴性乳腺癌细胞铁死亡、野马追内酯B靶向CDC37干扰CDC37与HSP90的蛋白互作、迷迭香酸靶向KRAS^G12C调控KRAS/AKT/ERK信号级联均通过炔基或半胱氨酸特异性探针结合竞争性实验完成。中药复方方向则体现了从复方到明确靶点的可能如蒲地蓝共价靶向GAPDH Cys150。此外还有老药新用肼屈嗪的靶点再发现、心血管保护羟基红花黄色素A与MDH1、衰老相关疾病咖啡酸作为senomorphic等方向。这些任务共同指向一个目标——把药物与蛋白如何相互作用这一模糊问题转化为在哪个残基、以何种化学形式发生作用的可检验命题。四、典型案例精读案例一蒲地蓝与黄芩素共价靶向 GAPDH Cys150。急性肺损伤ALI以巨噬细胞活化失调与细胞因子释放为特征。研究采用半胱氨酸反应性ABPP策略在巨噬细胞中绘制复方蒲地蓝Pudilan, PDL的共价靶点图谱并通过竞争性ABPP、CETSA、酶活性测定、生物膜层干涉BLI与分子对接验证靶点结合与功能影响。结果显示3-磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH是蒲地蓝的主要共价靶点且修饰位点为其催化性半胱氨酸残基Cys150进一步研究锁定黄芩素baicalein, BC是介导这一结合的主要活性成分。蒲地蓝与黄芩素均可共价结合GAPDH的Cys150并抑制其酶活性进而抑制糖酵解通量即巨噬细胞的Warburg效应促使代谢向氧化磷酸化OXPHOS方向转变并逆转促炎的M1型极化从而缓解急性肺损伤相关的炎症反应。该工作为复方—活性成分—直接靶点—代谢重编程提供了一条可验证的机制路径。参考文献Jiang M, et al.Phytomedicine, 2025.案例二咖啡酸共价靶向 Annexin A5作为 senomorphic。衰老细胞及其分泌的衰老相关分泌表型SASP在IPF的发病中起重要作用既往研究多集中于杀伤衰老细胞的senolytic药物而对靶点明确的senomorphic抑制SASP但不杀伤衰老细胞研究较少。研究发现天然产物咖啡酸caffeic acid, CA可作为senomorphic有效抑制衰老肺细胞中SASP的分泌机制上咖啡酸与Annexin A5蛋白的共价结合触发其降解、PKCθ失活进而抑制衰老细胞中的NF-κB炎症通路。在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中咖啡酸可减轻肺与循环系统炎症、改善肺病理并提升运动能力。该研究提示Annexin A5可作为IPF等衰老相关疾病精准干预的潜在靶点。文献Zhu Y, et al.Exploration, 2025.案例三羟基红花黄色素 AHSYA共价激活 MDH1 Cys137。心肌缺血/再灌注损伤MIRI是急性心肌梗死治疗中的关键问题。羟基红花黄色素AHSYA来源于红花Carthamus tinctoriusL.已被国家药品监督管理部门批准用于心脑血管疾病。研究采用还原二甲基化标记的串联正交酶解活性蛋白质组学rdTOP-ABPP结合LC-MS/MS鉴定其直接靶点与结合位点发现苹果酸脱氢酶 1MDH1是HSYA的核心靶点HSYA通过Cys137位点共价激活MDH1提升其生物能量学酶活性恢复线粒体能量代谢稳态。在MIRI小鼠模型中HSYA可缩小梗死面积、改善心功能、抑制凋亡并恢复心肌生物能量学在缺氧/复氧损伤的H9c2细胞中可剂量依赖性减轻线粒体损伤、降低ROS生成。干扰MDH1或其预测结合位点会显著削弱HSYA的心脏保护作用从因果角度支持MDH1为其功能靶点。文献Zhao F, et al.Phytomedicine, 2025.案例四肼屈嗪的靶点再发现——抑制 ADO。肼屈嗪hydralazine是临床使用超过70年的血管扩张药被列入世界卫生组织基本药物清单用于高血压危象与先兆子痫的治疗但其确切作用机制长期不明。研究团队利用化学蛋白质组学方法识别出2-氨基乙硫醇双加氧酶ADO是肼屈嗪的选择性靶点该药可螯合ADO的金属辅因子并可烷基化其配体由此使ADO失活ADO失活后其原本标记降解的G蛋白信号调节因子RGS4与RGS5得以稳定这为肼屈嗪的血管扩张作用提供了机制解释也与临床先兆子痫及其小鼠模型中RGS水平下降的观察相符。研究进一步提示ADO抑制可诱导胶质母细胞瘤细胞衰老为这一老药在肿瘤领域的新用途提供了线索。对长期机制不明、且存在多靶点相关副作用的药物而言明确其主要作用靶点是重新优化选择性、降低毒性副作用的前提。文献Shishikura K, et al.Sci Adv, 2025.小结从蒲地蓝的复方靶点、咖啡酸的衰老干预到HSYA的心肌保护与肼屈嗪的老药再发现这些案例共同表明isoTOP-ABPP及其衍生方法的价值不在于提供一套固定流程而在于围绕天然产物的化学性质与作用方式选择与之匹配的探针和实验设计并以多种正交验证手段配合支撑结论。同时也应看到这类方法的样本制备流程相对较长、操作较为复杂、成本也相对较高在合适的研究问题与充分的验证设计下使用它往往比为用而用更能体现其价值。