在部分H3K9me2标记位点CPL2–PHD2/3通过与SUVH4/5直接互作强化SUVH4/5–CMT2反馈环路在跨染色质域中维持DNA甲基化。在其他H3K9me2富集区域CPL2–PHD2/3在染色体臂和异染色质中促进RdDM。RdDM主要通过SHH1–CLSY1/2–Pol IV分支运作而异染色质中CLSY3/4–Pol IV通路作用有限。在部分H3K27me3标记位点CPL2–PHD2/3维持由SHH1–CLSY1/2–Pol IV分支驱动的RdDM在两个染色体区域中均发挥作用。在大部分H3K9me2和H3K27me3缺失位点CPL2–PHD2/3支持RdDM其活性主要由SHH1–CLSY1/2–Pol IV引导ZMP–CLSY3/4–Pol IV在全基因组范围内发挥次要作用。在DNA甲基化水平降低基因位点CPL2–PHD2/3在强LHP1–H3K27me3标记位点显示中等程度富集左但在弱标记中或无标记右位点结合更强从而促进转录抑制。其占位可能同时依赖于LHP1互作以及对H3K4me0和H3K4me1的识别使其能与LHP1协同产生差异性调控效应。研究方法1、遗传材料构建构建phd2/3双突变体phd2/3C并使用了已有的cpl2-2、aipp3-1、lhp1-4等突变体以及通过农杆菌转化获得的蛋白标签株系。2、多组学分析全基因组DNA甲基化测序WGBS对野生型Col-0和突变体cpl2-2, phd2/3C11 , phd2/3C19进行WGBS在全基因组范围内鉴定CHH、CHG和CG中的差异甲基化区域DMRs特别是关注CHH hypo-DMRs以评估CPL2-PHD2/3模块对DNA甲基化的作用。染色质免疫沉淀测序ChIP-seq利用已发表及本研究产生的ChIP-seq数据分析了多种组蛋白修饰H3K9me2, H3K27me3, H3K4me1, H3K4me3, H3K9ac, H3K27ac以及蛋白如LHP1, PHD3, Pol V在全基因组上的分布。通过将DMRs与这些染色质状态图谱进行整合阐明了CPL2-PHD2/3模块发挥功能的染色质环境。RNA测序RNA-seq对野生型和突变体进行转录组测序鉴定差异表达基因DEGs以评估CPL2-PHD2/3模块在转录沉默中的功能并将表达变化与染色质状态、蛋白结合数据进行关联分析。多组学整合分析对WGBS、ChIP-seq和RNA-seq数据进行关联分析包括DMR聚类分析、信号metaplot分析、不同突变体数据集如nrpe1, nrpd1, cmt2, suvh4/5/6, ddm1等的交叉比对以确定CPL2-PHD2/3调控的位点依赖于哪条具体的DNA甲基化通路。3、蛋白互作分析免疫沉淀-质谱联用IP-MS鉴定与CPL2、PHD2/3蛋白互作的复合体成员发现其与SUVH4/5、LHP1体内互作。分裂荧光素酶互补实验Split-Luc在植物体内验证CPL2、PHD2/3与SUVH4/5、LHP1之间的直接蛋白互作。酵母双杂交实验Y2H进一步验证并精细定位蛋白互作的结构域。结果图形1CPL2和PHD2/3协同调控长转座元件的CHH甲基化研究人员通过构建phd2/3 CRISPR双突变体phd2/3C并与cpl2-2突变体进行比较利用WGBS技术在全基因组范围内系统评估了DNA甲基化状态。分析结果显示在cpl2-2、phd2/3C11、phd2/3C19突变体中CHH 低甲基化差异区域hypo-DMRs的数量远超过其他序列背景CG, CHG的DMRs或高甲基化DMRshyper-DMRs表明CPL2-PHD2/3模块主要影响非对称的CHH甲基化图1A。超过80%的CHH hypo-DMRs与转座元件区域重叠图1B并且这些DMRs所关联的TEs长度显著长于基因组中所有注释TEs的平均长度显示出对长TEs的特异性图1C-D三个突变体之间的CHH hypo-DMRs显著重叠表明二者在功能上高度协同。尽管CPL2与PHD2/3存在蛋白互作图3I-J但转录水平上无相互调控提示CPL2-PHD2/3模块构成一个独立于AIPP3的亚复合体特异性维持CHH甲基化。WGBS技术在本研究中系统筛选出CPL2–PHD2/3模块的CHH甲基化靶标通过精确定量低甲基化水平并与已发表的cmt2、nrpd1等突变体数据集交叉比对为后续功能分析提供了准确的分子靶标。图1cpl2-2和phd2/3突变体中CHH低甲基化DMR特征。低甲基化DMRs的CHH甲基化水平。CHH低甲基化DMR的分布。CHH低甲基化DMR相关TE与所有TE及SIMs的长度比较。热图显示CHH低甲基化DMR相关TE、所有TE和SIMs在不同长度区间内的归一化比例。2CPL2–PHD2/3模块在不同染色质状态下介导TE的CHH甲基化与转录沉默为分析CPL2-PHD2/3模块发挥功能的染色质谱研究者将合并的CHH hypo-DMRs集合与组蛋白修饰ChIP-seq数据H3K9me2、H3K27me3进行交叉分析。根据与这些修饰的共定位情况将DMRs分为三个簇ClusterCluster In879富含H3K9me2其中9个同时含H3K27me3Cluster IIn365仅含H3K27me3Cluster IIIn1686不含这两种抑制性标记。Metaplot和热图分析图2A-B展示各簇特异性组蛋白修饰富集模式Cluster I和II分别在DMR主体及侧翼区域富集H3K9me2和H3K27me3且活跃染色质标记H3K9ac、H3K27ac、H3K4me3/me1在所有簇中均显著缺失。RNA-seq分析进一步显示在三个突变体中位于这些DMRs ±2kb bins内的转录本水平显著上调图2C表明CPL2-PHD2/3不仅维持甲基化也直接参与转录沉默。值得注意的是Cluster IH3K9me2富集的转录本水平始终低于其他簇且RNA Pol II占据最低这提示DNA甲基化与H3K9me2协同强化沉默。ChIP-seq通过组蛋白修饰图谱将DMRs功能异质性分层揭示了模块活性与染色质环境的依赖性关系。特别是PHD3在Cluster I-III均显示染色质富集图3F-G直接证明CPL2-PHD2/3模块通过鉴定不同的组蛋白密码H3K9me2、H3K27me3或H3K4me0实现多场景调控。图2CPL2–PHD2/3调控区域的染色质特征、表达谱以及与CHH低甲基化DMR的交叉分析。基于与H3K9me2、H3K27me3或两者皆缺失的重叠分析将合并的CHH低甲基化DMR分层为三个簇。各簇CHH低甲基化DMR ±1kb范围内指示组蛋白标记和RNA Pol II的归一化ChIP-seq信号热图和metaplot图以及比较各簇平均ChIP-seq信号箱线图。小提琴图显示各簇和基因型中的转录水平。CHH低甲基化DMR簇与突变体衍生DMR之间重叠的热图。每个簇的DMR与suvh4/5/6和nrpe1突变体CHH低甲基化DMR之间的重叠维恩图。箱线图显示各簇特异性DMR在不同基因型中的CHH甲基化水平。热图展示各簇DMR在不同基因型中的CHH甲基化模式。3根据不同染色质环境将CPL2–PHD2/3与不同甲基化通路重叠分析基于不同簇的染色质特征研究者将各簇的CHH hypo-DMRs与已发表的多种DNA甲基化通路缺失突变体如nrpe1/nrpd1代表RdDM缺陷cmt2代表CMT2缺陷suvh4/5/6代表H3K9甲基转移酶缺陷ddm1代表染色质量塑因子缺陷的WGBS数据进行重叠分析图2D-E。分析结果表明Cluster IH3K9me2富集的DMRs与suvh4/5/6、cmt2和ddm1突变体定义的区域广泛重叠与RdDM (nrpe1) 区域也有中度重叠表明在H3K9me2富集区该模块同时与SUVH4/5-CMT2环路和RdDM通路重叠。Cluster II和IIIH3K27me3或无标记则主要与RdDM缺陷突变体nrpe1, nrpd1的DMRs重叠与cmt2重叠极少。对甲基化水平定量分析图2F-G证实了这种通路依赖性。Cluster I的CHH甲基化在cmt2、suvh4/5/6和ddm1突变体中下降更显著而Cluster II和III的CHH甲基化则在RdDM突变体中几乎完全丧失。这些结果清晰地表明CPL2-PHD2/3模块是一个染色质环境响应因子能根据局部是富含H3K9me2还是H3K27me3或无标记选择性地与SUVH4/5-CMT2维持环路或RdDM de novo甲基化通路连接从而维持CHH甲基化。4CPL2–PHD2/3主要支持由SHH1–CLSY1/2–Pol IV分支引导的跨染色质域RdDM作者为了进一步解析CPL2-PHD2/3如何支持RdDM研究者将DMRs细分为更具体的调控类别CMT2特异、RdDM特异等。分析结果表明Clusters IIa和IIIa占Clusters II/III的75-80%仅与nrpd1-4 DMRs重叠而不与cmt2-7重叠图3A表明这些区域完全由RdDM调控。基因组定位显示Cluster Ia和Ib偏好性定位于近着丝粒异染色质而Clusters IIa和IIIa富集于染色体臂上图3B。甲基化分析揭示clsy1/2双突变体和shh1单突变体在所有簇中均导致CHH甲基化显著降低而clsy3/4影响有限图3C表明CPL2–PHD2/3主要依赖SHH1–CLSY1/2–Pol IV分支招募Pol IV。ChIP-seq数据显示Pol V在Clusters Ib、IIa和IIIa的DMRs上强富集且水平在臂区和异染色质区相当图3D-EPHD3同样在这些区域富集但表现出明显的臂区偏好性图3F-G。ChIP-seq通过Pol V和PHD3的占用率分析直接可视化CPL2–PHD2/3模块在RdDM通路中的空间定位证明了模块通过识别H3K4me0招募至Pol V靶位点且其活性与Pol IV招募分支的选择性密切相关。图3CPL2–PHD2/3模块根据不同染色质环境影响CHH DNA甲基化通路。UpSet图显示所指示的簇、nrpd1-4和cmt2-7突变体之间共有和特有的CHH低甲基化DMRs。A中DMRs的基因组分布划分为近着丝粒异染色质和染色体臂。不同基因型中DMRs±1 kb的CHH甲基化水平按子簇A和基因组位置B分层。在所指示的子簇DMRs ±1kb范围内Pol V的ChIP-seq信号的metaplot图和热图。箱线图比较按基因组位置B分层的各子簇Pol V的平均ChIP-seq信号。PHD3相应的ChIP-seq分析。IP-MS分析显示SUVH4与CPL2–PHD2/3模块共纯化箱线图。SUVH4与CPL2–PHD2/3模块共纯化表。分裂荧光素酶互补实验显示CPL2–PHD2/3与SUVH4/5在烟草本塞姆氏叶片中的互作。酵母双杂交实验对所选互作进行验证。5LHP1与CPL2–PHD2/3互作并在PHD2/3抑制基因位点与H3K27me3共定位CPL2-PHD2/3在基因沉默中的功能与Polycomb通路相关。RNA-seq分析发现phd2/3C突变体中上调的差异表达基因up-DEGs绝大多数60%与LHP1的ChIP-seq结合位点重叠且这些基因显著富集在H3K27me3标记的染色质状态CS-2, CS-4, CS-5中图4B、C、D。IP-MS和分裂荧光素酶互补实验证实了LHP1与CPL2、PHD2/3之间存在直接的物理互作图4F、H。结构域分析进一步揭示LHP1通过其Chromoshadow域CSD与CPL2和PHD2互作图4I。这些结果表明CPL2-PHD2/3模块与经典的Polycomb沉默reader蛋白LHP1存在功能关联并可能共同作用于H3K27me3标记的基因位点。图4LHP1与CPL2–PHD2/3模块物理互作并以H3K27me3依赖方式定位于PHD2/3调控基因。UpSet图显示所指示突变体之间上调差异表达基因up-DEGs的共有和独特集合。phd2/3C11∩19up-DEGs在预定义染色质状态CSs中的富集情况。H3K27me3的ChIP-seq富集分析在CS-2/4/5与所有其他染色质状态的基因体±1 kb范围内通过箱线图左和metaplot图右可视化展示。H3K27me3相关因子靶向的phd2/3C11∩19up-DEGs比例显示所有up-DEGs左及CS-2/4/5或Others亚群中的结果。LHP1的ChIP-seq富集分析。IP-MS分析显示LHP1与CPL2一同与PHD2/3共纯化。全长LHP1及其截短结构域构建体的互作实验示意图。分裂荧光素酶互补实验显示LHP1与PHD2/3或CPL2在烟草本塞姆氏叶片中的物理互作。酵母双杂交实验显示在含或不含3-AT的选择性互作。6CPL2–PHD2/3与LHP1–H3K27me3轴的依赖性协同关系在lhp1-4突变体中60.1%的上调DEGs270/449为LHP1直接结合靶标。尽管phd2/3C11∩1964.8%和cpl2-256.9%的上调基因也广泛被LHP1结合但仅有7.6%31/408和7.2%11/153的LHP1靶标在lhp1-4中同步去抑制表明CPL2–PHD2/3在多数LHP1结合位点是必需的下游抑制因子图5A。LHP1结合的靶基因呈现高H3K27me3、低H3K4me3/me1的特征染色质签名而非LHP1靶标则相反图5B。PHD3和AIPP3在两组基因中均持续富集且在非LHP1靶标中结合更强图5A。这种分布模式支持补偿性招募模型在H3K27me3富集位点LHP1主导并招募CPL2-PHD2/3而在H3K27me3缺失位点则由AIPP3通过BAH域识别H3K27me3或PHD2/3通过PHD域识别低甲基化H3K4来招募CPL2-PHD2/3从而实现沉默。ChIP-seq通过分层绘制基因集的组蛋白修饰谱揭示了LHP1与CPL2–PHD2/3的层级关系LHP1提供染色质定位信号而CPL2–PHD2/3是实际的抑制因子。